荧光分光光度法测定酶活性 分光光度计 连续检测酶促反应变化 实时获得数据

酶活性是指酶的转化能力，即能够分析的底物分子数量。影响酶活性的因素主要有环境因素，如温度、pH值、离子强度等。不同酶有最佳的条件，背离最佳条件时酶活性下降。亚基状况，如果酶亚基受到化学修饰，或亚基大分子解离，会影响酶的催化中心，降低活性，酶容易受热降解或者改性失活，导致活性下降。阻递物和竞争抑制剂，阻碍底物与酶结合的物质可以减弱酶的活性。

光学方法测定酶活性，如分光光度法、荧光法。通过检测底物消失或产物形成的光学信号变化来测定酶的活性。如荧光分光光度法测定大肠杆菌β-葡聚糖酶的活性就是通过检测产物的荧光信号。

分光光度法是测定酶活性的一种常用方法。主要原理在酶促反应过程中，产生或消耗的底物或产物具有特殊的荧光特征，可以用荧光分光光度法检测底物或产物的变化，从而反映出酶的活性变化。

荧光分光光度法测定酶活性具体操作步骤：

• 起始反应：将需要检测的酶溶解于合适的缓冲液中，加入底物和其他反应组分。
• 按一定时间间隔取样：通常每隔几分钟取样一次。
• 检测荧光信号：利用分光光度计检测反应液在特定波长下的荧光强度。
• 建立标准曲线：根据已知浓度的标准品制作标准曲线，将测得的荧光强度换算成浓度。
• 计算酶活性：根据不同时间点测得的底物或产物浓度，计算酶的反应速率，间接反映酶活性。
  

主要优点：

• 非破坏性，能连续检测酶反应的变化。
• 灵敏度高，能检测极低浓度的底物变化。
• 选择性强，只检测特定底物/产物的荧光。
• 测试快速，随时能获得酶反应进程的实时数据。

分光光度法适用于各种酶的活性测定，主要看所研究的酶能否引起底物或产物的荧光变化。测定酶活性的主要思路都是通过检测底物消耗或产物生成的变化来进行的。

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