关于用荧光分光光度计和DHE检测ROS的方法

检测ROS最主要的方法是利用荧光探针，比如二氢乙烯(DHE)。主要原理是二氢乙烯在与ROS反应后形成荧光的产物二氢乙烯八酮(DHEO)。检测样品DHEO的荧光强度变化就可以反映ROS的浓度。

使用DHE结合荧光分光光度计检测ROS的优点主要在其高灵敏、定量能力强、实时监测等方面。这些特点对于研究诸如线粒体膨胀等过程中ROS变化的研究尤为重要。而DHE的一些局限性，如产生背景荧光等，可以通过复制实验、重复检测等方式来校正。

具体操作如下:

• 溶解DHE(二氢乹烯)成为 stock 溶液。
• 将DHE加到需要检测的样品中，如分离后的线粒体样品。一般所用DHE浓度为5~20 μM。
• 将加有DHE的样品孵育一定时间，让DHE能进入细胞内。建议在37°C孵育30分钟。
• 用荧光分光光度计检测该样品的荧光强度。DHE在与ROS发生反应后，能被氧化成为红色荧光的二氢乙烯八酮(DHEO)。因此检测荧光强度即可反映ROS的含量。
• 激发波长一般选择为485nm，发射波长选择580nm。
• 根据标准曲线，计算出样品中的ROS浓度。制作DHE标准曲线时，需要使用已知浓度的H2O2 或其他ROS作为标准品。
• 在不同时间点重复检测，以观察ROS浓度的变化。

使用DHE检测ROS的主要限制在于：

• DHE自身也可能产生背景荧光
• 有部分DHE可能还原成未氧化的形式

但总的来说，DHE仍是一种敏感、有效的 ROS检测方法。它能很好地反映线粒体样品中ROS的变化情况，它的优点令它具有广泛的应用前景。

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